近日，『鲲石生物』与『朴衡科技』的战略合作成果，以“DNA orgami assembled spheroid for evaluating cytotoxicity and infiltration of chimeric antigen receptor macrophage (CAR-M) ”为题，上传至生命科学预印本平台“bioRxiv”上，其链接https://www.biorxiv.org/content/10.1101/2023.12.03.569750v1 在这项研究中，着重介绍了以3D NACs-origami组装的微肿瘤球体模型，用来评估CAR-M的靶向募集、杀伤和浸润能力，旨在为CAR-M的新靶点筛选和药效学评价提供一种有效的高通量验证平台。

介绍

  CAR-M的定义

     近年来，CAR-T细胞疗法在血液系统恶性肿瘤患者中取得了巨大的成就，成功地获FDA的批准进入临床，这也标志着细胞治疗时代的开启。然而，它们在治疗实体瘤治疗方面却存在一些不足，如低浸润，肿瘤微环境间的异质性等，反而这些特点促使CAR-M成为新的替代方案。CAR-M的最大优势在于，免疫浸润和强大的杀伤能力，对实体瘤的治疗方面起着积极的作用。

     CAR-M的定义即是采用特异性CARs（一种合成的跨膜受体）修饰巨噬细胞，以提高巨噬细胞对实体瘤的靶向识别肿瘤抗原，发挥其强大的吞噬和杀伤效应。除此之外，CAR-M还具有促进抗原提呈能力和增强T细胞杀伤的作用，以及改善肿瘤微环境中肿瘤相关巨噬细胞表型的作用，进而实现对实体肿瘤的有效杀伤。

      3D微肿瘤球体模型

     3D NACs-origami assembled spheroid是以生物核酸材料为载体，结合DNA折纸技术（简称NAC-organ技术）开发的一种快速自组装3D微肿瘤球体模型。本文中，我们利用NAC-organ技术构建出了3D卵巢癌的肿瘤微球，无需基质胶支撑，且方便长期培养。通过PBMC浸润实验结果表明，该模型可有效模拟肿瘤细胞与免疫细胞之间的交互行为，使免疫细胞能够主动侵入肿瘤模型，从而精确地再现了肿瘤免疫微环境。

结果与讨论

二维共培养模型评估CAR-M

(图 1)

图一 吞噬效率评估 左图为基于荧光成像的吞噬评估，靶细胞SKOV3被标记染料pHrodoSE，当CAR-M与靶细胞共培养6 hr后，在显微镜下可明显观察到CAR-M组有较多的吞噬事件。右图为基于流式分析的吞噬评估，靶细胞SKOV3被标记染料FarRed，当与CAR-M与靶细胞共培养6 hr后，CAR-M细胞的吞噬比例明显高于对照组。

(图2)

图二 杀伤能力评估 通过基于LDH方法（H）和基于Firefly luciferase方法(I)，一致地表明CAR-M有明显的的杀伤能力，且随E/T和不同时间点，杀伤效果有所变化。随着E:T比增加，CAR-M的杀伤效果具有增强趋势。

     总之，在二维共培养模型中的结果共同说明CAR-M具有显著的吞噬和杀伤作用。

PBMC与3D肿瘤微球互作形成肿瘤免疫微环境

(图 3)

图三 PBMC与3D肿瘤微球高通量互作模型（384孔板） 在3D微肿瘤模型构建24 hr后，分别加入小鼠PBMCs、PBMCs+免疫细胞抑制剂BLZ945、PBMCs+免疫刺激剂SEW2871，可观察PBMCs对3D微肿瘤球有侵袭行为。

CAR-M在3D肿瘤微球模型中的靶向、浸润和杀伤

(图 4)

图4 CAR-M细胞对3D肿瘤微球的靶向、浸润能力评估 将标记有GFP的M/CAR-M细胞分别加入3D肿瘤微球模型中，48 h后发现95%的CAR-M细胞侵入到3D肿瘤微球模型中，说明CAR-M对于3D肿瘤微球（SKOV3微球）模型中有较强的靶向募集和浸润能力。通过ATP和LDH检测，进一步证实CAR-M对3D肿瘤微球具有更强的杀伤能力。

总结

综上所述，我们建立了一种基于NACs-origami组装技术的三维肿瘤球体系统，用于体外评估CAR-Ms。更重要的是，该平台有利于CAR-Ms的其他靶点和其他肿瘤的验证，以及CAR-M联合疗法的评估，加速CAR-M的临床研究，为未来的临床治疗提供有利且可靠的证据。

参考文献

      DNA orgami assembled spheroid for evaluating cytotoxicity and infiltration of chimeric antigen receptor macrophage (CAR-M)sourcedoi: https://doi.org/10.1101/2023.12.03.569750

公司介绍

 鲲石生物专注于巨噬细胞药物治疗实体瘤开发和临床应用，是国内第一家具备基因编辑、生物材料和合成生物学驱动的工程化巨噬细胞技术平台。开创性地打造了全球首创的以巨噬细胞为核心的闭环产业链，具备批量打造基于CAR-M针对实体肿瘤管线的核心能力。

     朴衡科技专注于基于体外3D生理/病理模型的药物研发平台，以自主研发的全新体外3D培养技术(NAC-Organ技术)为基础，开发体外安全性、药效高通量筛选、评估平台。目前，建已立药物肝毒性及多种慢性肝病药效评估系统。针对肿瘤免疫细胞疗法开发的NAC-Solid Tumor平台，具有模拟免疫微环境、模拟不同细胞量级实体瘤的能力，可以用于肿瘤细胞靶向能力、肿瘤细胞杀伤能力的高通量检测。